芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质

作者:陈秀娟;周成;龚劲松;史劲松; 刊名:微生物学通报 上传者:韦青湖

【摘要】【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究。【方法】利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛。【结果】克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达。重组酶AprG最适反应温度为50°C,最适反应pH为10.0。各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强。底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低。AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显。【结论】蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景。

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蛋白酶广泛应用于医药[1]、皮革[2-3]、食品[4-5]、化妆品[6]等领域。其中,碱性蛋白酶用量占蛋白酶总量的50%左右。蛋白酶在动物[7]、植物[8]、微生物[9-10]中均存在。国内外研究的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。目前,大量研究表明,芽孢杆菌来源蛋白酶具有较好的脱毛效果,可以应用在制革工业中[11]。在制革工业中,利用酶法脱毛比传统灰碱法脱毛的污染更小,而且反应条件温和、水解效率高,可以有效提高制革工业的生产效率和经济效益。但是,酶法脱毛会对皮革中的胶原蛋白产生降解,因此筛选出脱毛效果较好且不会损伤胶原蛋白的蛋白酶具有十分重要的意义[12]。同时,在工业生产中经常使用大量的化学试剂,因此对表面活性剂耐受性、抗氧化性以及耐碱性等是蛋白酶的重要特性。黄东彦等[13]对蜡样芽胞杆菌YSQ08来源的碱性蛋白酶基因进行研究,并成功在酵母系统进行表达,此蛋白酶最适反应温度为55°C,最适pH为8.0,但Ni2+、Hg2+等金属离子显著抑制其活性。来源于芽孢杆菌A21的丝氨酸蛋白酶分子量为29 kD,在pH7.0-11.0稳定性较好,当p H升至12.0时,酶活迅速下降至20%以下,且氧化剂H2O2对其活性抑制作用明显[14]。本实验室前期从内蒙古盐碱湖中筛选得到一株产碱性蛋白酶菌株,其粗酶液对表面活性剂、金属离子、氧化剂和还原剂等耐受性较好。因此本研究中采用基因组文库法克隆其碱性蛋白酶基因,尝试对筛选得到的蛋白酶进行表达及酶学性质研究,并对此蛋白酶脱毛效果进行评价。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌株和质粒芽孢杆菌N1从内蒙古盐碱湖中筛选得到;大肠杆菌DH5α和BL21(DE3) pLysS感受态,北京全式金生物技术有限公司;克隆载体pUC118Bam H I/BAP,宝生物工程(大连)有限公司;表达载体pET-28a(+),本实验室保藏。1.1.2主要试剂和仪器实验中所用d NTPs、r Taq、λ-HindⅢdigest、500 bp DNA ladder、DL2000 DNA marker,TaKaRa公司;Sau3A I、Buffer 1.1,Bio-Labs公司;蛋白胨、酵母粉,OXOID公司;脱脂奶粉,碧迪医疗器械有限公司。高速冷冻离心机,安徽嘉文仪器有限公司;pH计,德国赛多利斯(Sartorius)公司。1.1.3培养基野生菌培养基(g/L):酵母膏1.0,胰蛋白胨10.0,氯化钠30.0,硫酸镁0.2,氯化钙0.1,磷酸氢二钾1.0,用10%碳酸钠调节p H至10.5;筛选培养基:LB培养基中添加10.0 g/L脱脂牛奶,用10%碳酸钠调节p H至7.0;1.2实验方法1.2.1基因组文库构建及功能基因筛选将已活化的芽孢杆菌N1培养液按照1%接种量转接于200 m L野生菌培养基,培养至OD600约为0.6,收集菌体。采用酚/氯仿/异戊醇法进行芽孢杆菌N1总DNA的提取。Sau3A I酶切芽孢杆菌N1基因组,回收其中的3-8 kb酶切片段,连接至pUC118 Bam H I/BAP载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,复苏后涂布至筛选培养基。筛选具有透明圈的菌落,扩大培养后提取重组质粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所获得的基因序列在NCBI上比对分析,并与相似性最高的几个蛋白酶序列进行比对。1.2.2重组菌构建设计引物GSF-1 (5?-CATGCCATGGATATGATTGAAGCACCAGCC-3?)、GSF (5?-CATGCCATGGATTTGAGTAAAGTGAGCCTGATTCC-3?)和GSR

参考文献

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